Yeni Nesil Dizileme (NGS)

Yeni nesil dizileme (NGS), milyonlarca nükleik asidin aynı anda paralel olarak dizilenmesine olanak tanıyan yüksek verimli bir tekniktir.

Temel özellikler

Klinik kullanımı kolaylaştıran yüksek verimli ve uygun maliyetli dizilemeye olanak tanır.

Yeni nesil dizilemenin farklı yöntemleri temel olarak kısa okuma (pirosekanslama, sentezle dizileme, ligasyonla dizileme, iyon sel) ve uzun okuma (tek molekül gerçek zamanlı dizileme, nanogözenek dizileme) olarak ikiye ayrılır.

Klinik uygulamalara öncelikle onkoloji panelleri ve germ hattı panelleri ile birlikte yeni ortaya çıkan tüm ekzom dizilemesi/tüm genom dizilemesi dahildir.

Terminoloji

Yeni nesil dizileme (NGS), büyük oranda paralel dizileme, tüm genom dizilemesi (WGS), tüm ekzom dizilemesi (WES), RNA dizilemesi (RNA seq), metilasyon dizilemesi (metil seq) ve kromatin immünoçöktürme dizilemesi (ChIP seq)

Tarihçe

20. yüzyılın başlarında, birçok araştırma hücre sinyal yollarını ve hücresel yapı taşlarını aydınlatmaya çalıştı. ( Biomark Insights 2010;5:9 , Int J Mol Sci 2019;20:3292 , Nature 2017;550:345 )

• 1921 – 1922: Frederick Banting ve Charles Best, peptit hormonu insülini keşfetti.
• 1953: Fred Sanger insülinin amino asit dizisini yayınladı ve diğer proteinlerin amino asit dizilerini belirleme çabalarını başlattı.

Proteinlerin amino asit dizilerinin belirlenmesindeki başarı, genetik materyalin dizilenmesine yönelik çabalara ilham kaynağı oldu ( Nature 2017;550:345 )

• 1965: İlk RNA dizileri belirlendi ve yayınlandı (tanımlanan ilk dizi alanin tRNA’sıydı)
• DNA dizilimi, Sanger ve Coulson ile Maxam ve Gilbert’in 1976 – 1977 yıllarında daha yüksek verimli DNA dizilimi yöntemlerini yayınlamasına kadar daha zorlu ve zahmetli olduğu kanıtlandı
  • Sanger ve Coulson yöntemi: DNA primerleri ve DNA polimeraz kullanılarak zincir sonlandırma
  • Maxam ve Gilbert yöntemi: restriksiyon parçalanması ve baz spesifik kimyasal bölünme

Hem Sanger ve Coulson’un (Sanger dizilemesi) hem de Maxam ve Gilbert’in yöntemleri hemen kullanıldı ve yeni DNA dizileme projelerinin üstel büyümesini teşvik etti ( Nature 2017;550:345 )

• Her iki DNA dizileme yöntemi de yayınlandıktan kısa bir süre sonra, shotgun dizileme yöntemleri (dizilerin örtüşmesiyle belirlenen birleşimlerle rastgele klonların dizilenmesi) 1979 – 1980 yıllarında yayınlandı.

DNA dizileme çabalarının büyümesi, veri tabanları ve arama araçları (örneğin NCBI BLAST, GenBank, vb.) dahil olmak üzere biyoenformatik teknolojisi ve kaynaklarındaki ilerlemeleri müjdeledi ( Nature 2017;550:345 )

• 1980 – 1990’lar: büyük ölçüde paralel dizileme yöntemleri tanımlandı
• 1990 – 2004: O dönemde yürütülen en iddialı dizileme projesi olduğu düşünülen İnsan Genomu Projesi gerçekleştirildi ve insan genomunun büyük bir kısmının nihai dizisi 2004 yılında yayınlandı
  • Projenin iddialı yapısı biyoenformatik ve genetik teknolojilerinde gelişmelere yol açtı (daha yüksek verim ve doğrulukla daha verimli süreçler gerektirdi, vb.)
• 2000’ler – 2010: Büyük ölçüde paralel dizileme yöntemleri Sanger dizileme yöntemlerinin yerini aldı ve ilk NGS makineleri ticari olarak piyasaya sunuldu.

Sanger dizilemesi

Altın standart

• Uzun okumalarda yüksek doğruluk sağlayan tarihi altın standart; ancak NGS yöntemlerinin doğruluğu (%99,965 doğrulama oranı), verimliliği ve maliyet etkinliği klinik ve araştırma ortamlarında Sanger dizilemesini büyük ölçüde gölgede bırakmıştır ( Clin Chem 2016;62:647 )

Yöntem: Diziyi belirlemek için modifiye dideoksinükleotidlerle zincir sonlandırmayı kullanır.

Avantajları: Herhangi bir hedefi (DNA, RNA, epigenetik değişiklikler) sıralayabilir, yüksek kalite, uzun okuma uzunlukları.

Dezavantajları: yüksek maliyet (özellikle daha uzun dizilerde ve birden fazla gen/lokus dizilenirken), düşük verim, zaman alıcı ve tümör örneklerinde somatik varyantları ve yapısal varyantları tanımlamak için yetersiz duyarlılık, primer tasarımı ve amplifikasyonu için ilgi duyulan dizileri bilmek gerekir.

Kullanım: NGS verileri için doğrulama aracı; klinik ve araştırma ortamlarında birincil dizileme yöntemi olarak kullanımı azalıyor.

NGS metodolojisine genel bakış

Kütüphane hazırlama, çoğaltma ve dizilemeden oluşan büyük çaplı paralel dizileme yöntemlerini kullanır.

Kütüphane (örnek) hazırlama: DNA’nın rastgele parçalanması ve ardından ortak adaptör dizilerinin bağlanması

• Örnek girişi: DNA molekülleri (kandan, kemik iliğinden, yanak sürüntüsünden, tükürükten, formalinle fikse edilmiş parafine gömülü dokudan, vb.)
• Parçalanma: DNA’yı enzimatik olarak (restriksiyon enzimi, transpozaz), sonik olarak veya mekanik olarak rastgele boyutlara parçalayın (genellikle kısa okuma dizilemesi için 200 – 300 nükleotid)
• Hedef DNA’nın modifikasyonu
  • Adaptörler: Parçalanmış DNA örneklerinin uçlarına birden fazla işlevi yerine getiren benzersiz DNA dizileri eklenir
    • Aynı çalışmada farklı örneklerin çoklu olarak işlenmesi için hasta tanımlayıcılarını içeren bir barkod (indeks) sağlayın
    • Dizilerin dizileme çiplerine/boncuklarına hibridizasyonuna izin verin
    • Amplifikasyon ve dizileme primerleri için evrensel astarlama noktaları olarak hizmet eder
• Zenginleştirme: Bu adım yalnızca belirli genomik bölgelerin (hastalık gen panelleri, ekzomlar, vb.) analiz edilmesi durumunda gereklidir.
  • PCR amplifikasyonu (amplikon)
    • Avantajları: daha küçük genomik bölgeler için idealdir
    • Dezavantajları: İlgi duyulan hedefi kaçırabilir (daha düşük hassasiyet)
  • Dizi yakalama / hibridizasyon
    • Yemler (biyotinlenmiş RNA veya DNA oligonükleotidleri) DNA’nın belirli bölgelerine bağlanır
    • Avantajları: daha büyük genomik bölgeler için idealdir
    • Dezavantajları: hedef dışı yakalama nedeniyle hedef bölgeler için daha düşük zenginleştirme (daha düşük özgüllük)

Amplifikasyon ve küme oluşturma

• Her molekül, tek bir şablon parçasından türetilen PCR amplikonlarının orijinal moleküle yakın bir mesafede kümelenmesini sağlayan multipleks PCR kullanılarak bir yüzey (çip, akış hücresi, boncuklar, nano küre, vb.) üzerinde immobilize edilir ve çoğaltılır ( Nat Rev Genet 2016;17:333 )
  • Boncuk tabanlı sistemler: Belirli bir oligonükleotid parçasına tamamlayıcı 1 adaptör bir boncuğa sabitlenir ve milyonlarca klonal DNA parçasının tek bir boncuk üzerine sabitlendiği emülsiyon PCR yoluyla amplifikasyon gerçekleşir
  • Katı yüzey sistemleri: adaptör, oligonükleotidi çipe belirli bir konumda sabitler
    • Amplifikasyon, doğrudan slayt üzerinde köprü PCR yoluyla gerçekleşir; burada ileri ve geri primerler yüzeye bağlanır ve bu da tamamlayıcı tek zincirli DNA parçaları için bağlanma yerleri sağlar
    • Akış hücreleri: Slayt üzerindeki primerlerin kesin konumunu tanımlayan ve daha yüksek verim sağlayan desenli katı yüzey sistemi
  • DNA nanoball’ları: çözeltide, DNA tekrar tekrar bağlanır, daireselleştirilir ve 4 benzersiz adaptör bölgesi ile kesilir
  • Daha sonra, desenli bir slayt üzerine dağıtılan DNA nano küreleri oluşturmak için yuvarlanan daire amplifikasyonu kullanılır

Dizileme

• Her küme, ayrı bir dizileme reaksiyonu olarak hareket edecek ve birden fazla numuneden gelen kütüphaneler paralel olarak aynı anda dizilenebilecek
• Okunuyor: dizileme çıktısı; orijinal şablon molekülünün dizisini temsil eden nükleotid dizisi
• Çift uç okumaları: DNA şablonu her iki uçtan dizilenir ve hem ileri hem de geri okumalar gelişmiş haritalama, kapsama ve verime olanak tanır ( Nat Rev Genet 2016;17:333 )
  • İleri ve geri okumalar arasında asimetri varsa yapısal düzenlemelerin tanımlanmasına yardımcı olabilir
• NGS platformlarının kategorilendirilmesi ( Platform işlevleri ve yöntemleri hakkında bilgi için NGS için Platformlar bölümüne bakın)
  • Nesiller ( Nat Rev Genet 2016;17:333 )
    • İkinci nesil: PCR’ye bağımlı
      • Pirosekanslama (Roche 454 sistemi)
      • Ligasyonla dizileme (AB SOLiD sistemi, Complete Genomics, Polonator G.007, vb.)
      • Sentez yoluyla dizileme (Illumina, Qiagen GeneReader)
      • İyon yarı iletken dizilemesi (Thermo Fisher’dan Ion Torrent)
    • Üçüncü nesil: PCR’ye gerek kalmadan gerçek zamanlı dizileme
      • Tek molekül gerçek zamanlı (SMRT) (PacBio, Roche)
      • Nanopore (Oxford Nanopore Teknolojileri)
• Kısa okuma ve uzun okuma ( Int J Mol Sci 2017;18:E308 )
  • Kısa okuma: < 300 baz çiftini okur
    • Örnekler: sentez yoluyla dizileme, ligasyon yoluyla dizileme, pirosekanslama
    • Avantajlar: Gb başına düşük maliyet, yüksek doğruluk
    • Dezavantajları: Azalmış hizalama, yapısal düzenlemelerin sınırlı tespiti ve çözümü
  • Uzun okuma: 2,5 Kb’den büyük okunur.
    • Örnekler: tek molekül gerçek zamanlı (SMRT), nanopore
    • Avantajlar: iyileştirilmiş hizalama, yapısal varyasyonların ve büyük yeniden düzenlemelerin tespiti, tekrarlayan bölgelerin dizilenmesi, yeni RNA transkript izoformlarının keşfi, PCR’ye güvenilmemesi taşınabilirliği ve işlem süresini iyileştirir.
    • Dezavantajları: Gb başına yüksek maliyet, düşük doğruluk
      • Okuma derinliğini artırmayı da içeren yöntem ve biyoenformatik algoritma iyileştirmesi, maliyeti hala kısa okuma yöntemlerinden daha fazla olmasına rağmen doğruluğu %98’e kadar artırmıştır ( Nat Rev Genet 2020;21:597 )

Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku (FFPE)

Genetik test için kullanılan en yaygın örnek türlerinden biridir. Mutlaka örnek patoloji laboratuvarında ve Patolog tarafından seçilmelidir. Yeteri kadar tümör dokusu içermeyen örnekler yanlış pozitif ya da yanlış negatif sonuçlara neden olabilir. Örneğin tümör dokusundan yeteri kadar içerip-içermediğini. Mikroskop altında inceleme yapan Patolog karar verebilir. FFPE, NGS testi için klinik olarak uygun bir örnek türü sağlar.

Genel iş akışı

• Tru-cut biyopsiler ve ince iğne aspirasyonları (FNA) genellikle birincil tümör tanısı için doku elde etmek amacıyla kullanılır.
  • Eksizyonel biyopsiler ve rezeksiyonlar gibi daha büyük cerrahi örnekler, ilk tanı için daha az sıklıkla elde edilir.
• Doku formalinle sabitlenir ve histopatolojik değerlendirme için parafin bloka gömülür.
• Kesitli doku, tanı koymak için morfoloji veya immünofenotip açısından değerlendirilir.
• Parafin bloğunda kalan doku, NGS ile moleküler analiz de dahil olmak üzere yardımcı testler için kullanılabilir.

Bu iş akışıyla, yeni bir kanser tanısı için gerekli tüm tanı testleri, tek bir küçük biyopsiden elde edilen materyal üzerinde tamamlanabilir ve bu sayede hastanın daha invaziv cerrahi prosedürlere maruz kalması en aza indirilirken, klinisyenlerin terapötik yönetimi optimize etmesine yardımcı olunur.

NGS testleri için FFPE’nin avantajları

• Arşivlenebilir doku
  • FFPE dokusundaki DNA nispeten stabildir ve tümörlerin retrospektif analizine olanak tanır.
  • DNA miktarı ve canlılığı ortam koşullarında zamanla azalır (bazı çalışmalarda miktar %50’nin altına düşmüştür ve 4-6 yıl sonra sadece %11’i çoğaltılabilmektedir) ( J Pers Med 2022;12:750 )
  • FFPE’yi daha düşük sıcaklıklarda saklamak veya FFPE dokusunu dondurmak, FFPE’deki genetik materyali daha iyi korumak için bir yol olarak önerilmiştir (ancak bu öneriyi değerlendirmek için daha fazla veriye ihtiyaç vardır ve bu muhtemelen FFPE’yi saklamanın maliyetini artıracaktır) ( J Pers Med 2022;12:750 )
• Histolojik analiz
  • Tanıya ek olarak, örneklerin morfolojik analizi, NGS örneğindeki son tümör yüzdesini en üst düzeye çıkarmak için tümör dışı örneğin geri kalanından tümörün makrodiseksiyonuna da olanak tanır.
  • Bazı yeni araştırmalar, farklı immünohistokimyasal profillere sahip tümör bölgelerinde NGS uygulayarak farklı immünofenotiplere sahip tümör bölgeleri arasındaki genomik farklılıkları ayırt etmenin mümkün olabileceğini belirtmektedir; ancak bazı araştırmalarda immünboyama için gereken ek işlem adımlarının DNA miktarını ve kalitesini azalttığı gösterilmiştir ( PLoS One 2017;12:e0176280 )
• Taşıma kolaylığı
  • Bloklar halinde veya slaytlar üzerinde kesilmiş FFPE doku, ortam koşullarında taşınabilir ve önemli biyolojik tehlikeler oluşturmaz (taze doku, kan, kemik iliği, beyin-omurilik sıvısı vb. gibi numunelerin işlenmesiyle ilişkili daha sıkı taşıma gereksinimleri ve potansiyel enfeksiyon tehlikeleriyle karşılaştırıldığında).

İdeal FFPE numunesini elde etmeyle ilişkili zorluklar

• Analiz öncesi hataların azaltılması
  • Sıcak ve soğuk iskemik süreleri azaltmak için örnekler mümkün olan en kısa sürede hastadan alınmalı ve formalin içine yerleştirilmelidir (formalinin daha fazla ve daha eşit şekilde nüfuz etmesini sağlamak için uygun kesitlerle).
    • Uzun süreli sıcak iskemi (numunenin hastadan çıkarılırken perfüzyonunun azalmasıyla oluşur) ve soğuk iskemi (numunenin formalin içine yerleştirilmesi/saklanması sırasında oluşur) genetik materyalin bozulması ve belirli transkriptlerde potansiyel artışlar ve azalmalar dahil olmak üzere bir dizi genetik değişiklikle ilişkilidir (RNA, DNA’ya kıyasla daha kararsız olduğundan, potansiyel bozulma etkilerine özellikle eğilimlidir) ( J Pers Med 2022;12:750 )
  • Örnekleme sırasında tümör hacmi ve tümör yüzdesi optimize edilmelidir.
    • Bir numunede analiz için mevcut tümör miktarı, NGS testinin başarısını önemli ölçüde etkileyen ön analitik faktörlerden biridir ( Am J Clin Pathol 2016;145:222 )
    • Genellikle, test için gönderilen numunenin en az %20’sinin tümör olması önerilir ( Am J Clin Pathol 2016;145:222 )
    • Birçok üretici, NGS testinde en büyük başarıyı elde etmek için en az 10 ng tümör DNA’sının çıkarılmasını da önermektedir ( Am J Clin Pathol 2016;145:222 )
      • Illumina gibi platformlar, hibrit yakalama testleri için numune başına en az 15.000 tümör hücresi önermektedir ( J Pers Med 2022;12:750 )
      • Ion Torrent platformu, deney başına 100 – 1000 tümör hücresi gerektirir ( J Pers Med 2022;12:750 )
    • Daha büyük örnekler (eksizyonlar ve rezeksiyonlar) çekirdek biyopsiler ve FNA örneklerine kıyasla daha büyük tümör hacmi ve tümör yüzdesi elde etme olasılığı daha yüksektir.
      • Rezeksiyon örnekleri ve eksizyonel biyopsiler daha yüksek NGS başarı oranlarıyla ilişkilidir ( Am J Clin Pathol 2016;145:222 )
    • Tru-cut biyopsiler ve ince iğne aspirasyon biyopsileri tümörden yetersiz parçalar/tümör hücresi kümeleri verebilir veya tümör dışı hücrelere (örneğin iltihaplı hücreler ve normal çevreleyen doku) kıyasla düşük oranda tümör hücresi içeren örneklerle sonuçlanabilir.
      • Düşük tümör hücreselliği, tümör hücrelerine özgü anlamlı genetik analizleri engelleyebilir.
    • Tru-cut biyopsiler ve ince iğne aspirasyon biyopsisi örnekleri gibi daha küçük veya daha sınırlı örnekler elde edildiğinde, biyopsi materyalinin hızlı yerinde değerlendirilmesi (ROSE) gibi süreçler, hem morfolojik hem de yardımcı testler (NGS analizi gibi) için son örnekteki tümör hacmini en üst düzeye çıkarmak amacıyla örnek örneklemesinin sınıflandırılmasına yardımcı olabilir ( J Pers Med 2022;12:750 )
• NGS çalışmaları için genetik materyalin optimum kalitesini ve miktarını sağlamak için yeterli formalin fiksasyonu kritik öneme sahiptir.
  • Morfoloji ve NGS gibi yardımcı çalışmalara göre numunelerin analizi için %10 formalinde 12 – 24 saatlik fiksasyon önerilir ( J Pers Med 2022;12:750 , Int J Mol Sci 2016;17:1579 , PLoS One 2017;12:e0176280 )
  • Yetersiz fiksasyon, dokuların ve genetik materyalin enzimatik bozulmasına neden olabilir.
  • Aşırı fiksasyon, daha fazla formalin fiksasyonuna bağlı eserlerin (500 bazda 1 modifikasyona kadar) oluşumuna yol açabilir.
  • Genetik materyalin çıkarılması ve NGS kütüphanelerinin oluşturulması sırasında, DNA’dan çapraz bağları ve urasil bazlarını çıkarmak ve yüksek hacimli ssDNA parçalarını azaltmak için enzimatik işlemler gibi ek adımlar, fiksasyon eserlerini ve CNV’lerin ve tek nükleotid varyantlarının (SNV’ler) yanlış tespitlerini azaltmaya yardımcı olabilir.
• Mümkünse ek doku işleme adımları (örneğin kalsifikasyon giderme) atlanmalıdır.
  • Kemik ve diğer önemli ölçüde kalsifiye olmuş dokular daha düşük NGS başarısıyla ilişkilidir. ( J Pers Med 2022;12:750 , Am J Clin Pathol 2016;145:222 )
  • Kireç çözme (dekalsifkasyon), genetik materyali parçalayan güçlü (hidroklorik ve nitrik) veya zayıf (pikrik, formin, asetik) asitlerin veya şelat oluşturucu ajanların (EDTA) kullanımını gerektirir.
    • Zayıf asitlere ve EDTA’ya kısa süreli maruz kalma, SNV’lerin, CNV’lerin ve füzyon transkriptlerinin tespiti için yeterli DNA’nın çıkarılmasına hala izin verebilir. ( J Pers Med 2022;12:750 )
  • Genel olarak, birincil tümörün biyopsisi zorsa ve kemik ve diğer dokulara çok sayıda metastazı varsa, kemik dışı metastazlardan biyopsi alınması, NGS yoluyla başarılı bir şekilde analiz edilme olasılığı daha yüksek olan dokuların elde edilmesiyle sonuçlanabilir. ( Am J Clin Pathol 2016;145:222 )
• FFPE’den genetik materyal çıkarma yöntemleri, NGS için kullanılan materyalin miktarını ve kalitesini de önemli ölçüde etkileyebilir.
  • Çalışmalar, farklı ekstraksiyon kitlerinin (kolonlar, manyetik boncuklar vb. gibi farklı reaktifler veya saflaştırma yöntemleri kullanılarak) ekstrakte edilen materyalin nihai verimi, saflığı ve kalitesi açısından farklılık gösterdiğini göstermiştir. ( Int J Mol Sci 2016;17:1579 )
  • Özellikle düşük tümör hacmi/yüzdesine sahip küçük örneklerle çalışıldığında, çıkarma işleminin verimliliğini, kalitesini ve verimini en üst düzeye çıkarmak esastır. ( Int J Mol Sci 2016;17:1579 )

Veri çıktısı ve analizi

Demultipleksleme: Eş zamanlı olarak dizilenen birleştirilmiş hasta örnekleri (örnek kütüphaneleri) daha sonra her hasta örneğine özgü barkodlarla (indeksler) ayrılır

Okumalar, dizi benzerliğine göre fiziksel olarak kümelenir ve ileri ve geri okumalar hizalanır (eşleştirilir)

Hizalama

• Yeniden dizileme: Dizi okumaları referans diziye (bir bireyin referans genomuna) göre hizalanır.
• De novo: diziler birbirine hizalanmış şekilde okunur.

Yorum: patojenik, muhtemelen patojenik, belirsiz öneme sahip varyant, muhtemelen iyi huylu, iyi huylu ( J Mol Diagn 2017;19:4 , Genet Med 2015;17:405 )

NGS’nin avantajları (Sanger dizilemesiyle karşılaştırıldığında)

• Yüksek verim/çıktı
• İyileştirilmiş çözünürlük
• Maliyet etkin
• Yapısal farklılıkları tespit edebilen algoritmalar mevcuttur

NGS’nin dezavantajları (Sanger dizilemesiyle karşılaştırıldığında)

• Daha kısa okuma uzunlukları
• Homoloji alanlarında (psödogenler gibi), tekrar genişlemelerinde, büyük eklemelerde, kopya sayısı varyantlarında (CNV’ler) veya diğer yapısal varyantlarda ham doğrulukta azalma
  • Genetik olaylar genellikle benzersiz olmayan dizilerde (sentromerik DNA, tekrarlayan elemanlar, vb.) meydana gelir ve bu da NGS ile tanımlamayı zorlaştırır
• Yüksek başlangıç ​​maliyetleri

NGS için Platformlar

Pirosekanslama

• Ticari olarak başarılı ilk NGS sistemi
• Dizileme mekanizması
  • Şablonla bağlanan boncuklar, enzim içeren boncukların bulunduğu bir tabağa dağıtılır.
  • 4 nükleotidin her birinden 1 tanesi dizileme reaksiyonuna iteratif olarak eklenir.
  • Nükleotid katılımı sırasında pirofosfat (Ppi) salınır ve Ppi salınımı, katılan nükleotid miktarına eşittir.
• Örnek: 454 sistemi (Roche)
• Avantajları: hızlı, uzun okuma uzunluğu
• Dezavantajları: reaktiflerin yüksek maliyeti, polibaz > 6 ile nispeten yüksek hata oranı, düşük verim ( J Biomed Biotechnol 2012;2012:251364 )

Ligasyonla dizileme

• Dizileme mekanizması: Etiketli probun DNA ipliğine hibridizasyonu ve bağlanması
  • 2 prob spesifik baz ve 6 dejenerat baz içeren oktamer oligonükleotid problarını kullanır
  • Her bir prob, son baza bağlı 4 floresan boyadan birine, birinci bazda bir ligasyon alanına ve beşinci bazda bir ayrılma alanına sahip olacak
  • Dizileme, prob ve şablon arasındaki tamamlayıcı bağlanma ile gerçekleşir ve ankraj körleri adaptöre tamamlayıcı olarak bağlanır ve ligasyon için bir başlatma noktası görevi görür
  • Daha sonra serbest bırakılan floresans görüntülenir
  • Floresan sinyali ve oktamerin son 4 nükleotidi koparılır ve döngü devam eder
  • Birkaç hibridizasyon, ligasyon ve kesme döngüsünden sonra, DNA zinciri denatüre edilir ve reaksiyonu tekrarlamak için 1 bazla kaydırılmış başka bir dizileme primeri kullanılır
  • Toplamda 5 dizileme primeri kullanılır ve parçanın dizisi yaklaşık 5 dizileme turundan sonra çıkarılabilir
• Örnek: AB SOLiD sistemi (Thermo Fisher)
• Avantajları: İkinci nesil NGS’nin en yüksek doğruluğu, polimeraza bağımlı olmama
• Dezavantajları: kısa dizileme okumaları ( Nat Rev Genet 2016;17:333 , J Biomed Biotechnol 2012;2012:251364 )

Sentez yoluyla dizileme (SBS)

• Klinik uygulamalarda kullanılan en yaygın yöntemlerden biri ( Arch Pathol Lab Med 2017;141:1544 )
• Dizileme mekanizması
  • Her döngüde, farklı ayrılabilir floresan boyalar ve çıkarılabilir bir blokaj grubu içeren akış hücresine tüm 4 deoksinükleotid trifosfat (dNTP) eklenir
  • DNA polimerazı tarafından floresanla işaretlenmiş dNTP’nin dahil edilmesi, her döngüde polimerizasyonu sonlandırır ve floresan sinyali, büyüyen DNA ipliğine özgül nükleotidi belirler
  • Floresan boya ve bloke edici grup enzimatik olarak parçalanır, böylece bir sonraki döngü sırasında yeni bir nükleotid eklenebilir
• Örnek: Illumina dizilemesi (MiSeq, HiSeq, NextSeq ve NovaSeq platformları)
• Avantajları: yüksek doğruluk (baz baz diziler), en büyük çıktı, en ucuz, tek nükleotid ekleme platformlarına (Ion Torrent, pirosekanslama) göre homopolimer hatalarına daha az duyarlı
• Dezavantajları: döngüsel yapısı uzun dizileme sürelerine, kısa okuma birleştirmeye yol açar ( Coleman: Diagnostic Molecular Pathology, 2016 , Nat Rev Genet 2016;17:333 , J Biomed Biotechnol 2012;2012:251364 )

İyon yarı iletken dizilemesi

• Klinik uygulamalarda kullanılan en yaygın yöntemlerden biri ( Arch Pathol Lab Med 2017;141:1544 )
• Dizileme mekanizması: İyon Torrent dizilemesi (yarı iletken dizilemesi)
  • DNA parçaları boncuklar üzerinde zenginleştirilir ve daha sonra bir mikro kuyu plakasına dizilir, böylece yalnızca bir boncuk bir kuyuyu kaplar
  • Değiştirilmemiş tek nükleotidler mikrokuyu çipe ardışık olarak eklenir (tek nükleotid eklenmesiyle dizileme)
  • DNA polimerazı tarafından bir nükleotidin dahil edilmesi, tamamlayıcı bir nükleotidin her eklendiğinde pH’daki değişikliklere duyarlı bir iyon sensörü tarafından tespit edilen bir protonun salınmasına neden olur
  • Sıra, her ardışık nükleotid maruziyeti sırasında elektrik sinyali yoğunluğunun değerlendirilmesiyle belirlenir
• Örnek: Ion Torrent (Thermo Fisher)
• Avantajları: hızlı dizileme (kamera veya floresansa bağımlı olmama), düşük maliyet, daha küçük cihaz boyutu
• Bakım noktası testleri ve gen panelleri için kullanışlıdır
• Dezavantajları: artan homopolimer hatasıyla daha az doğruluk ( Nat Rev Genet 2016;17:333 )

Tek molekül gerçek zamanlı (SMRT) dizileme

• Diğer sistemlerle karşılaştırıldığında, eklenen her dNTP için hedef bölgenin klonal amplifikasyonuna veya kimyasal döngüye güvenilmez
• Dizileme mekanizması
  • Her biri tek bir immobilize polimeraz ve hedef molekülün bir kopyasını içeren binlerce mikro kuyuya sahip özel akış hücresi, genellikle birden fazla kez dizilenebilen dairesel bir şablon
  • Mikrokuyular, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin fazlasıyla doldurulur
  • Boya, DNA polimerazı tarafından dahil edilme sırasında parçalanır, bu da boyanın sensörden uzaklaşmasına ve DNA polimerazının aktif bölgesinin bir sonraki dNTP için kullanılabilir hale gelmesine olanak tanır
  • Mikrokuyudaki ışık dedektörü, nükleotidler dahil edildikçe sinyali gerçek zamanlı olarak algılar
• Örnek: Pacific Biosciences
• Avantajları: en hızlı yöntem, daha uzun hedefleri sıralayabilir, PCR’ye atfedilen önyargıyı ve hatayı azaltır, yeni genom birleştirme uygulamaları için idealdir, gerçek zamanlı veri üretimi
• Dezavantajları: daha düşük doğruluk ve verim ( Nat Rev Genet 2016;17:333 , J Biomed Biotechnol 2012;2012:251364 )
  • Platform performansındaki iyileştirmeler, artan verim (PacBio Sequence II platformunda akış hücresi başına 160 Gb’ye kadar) dahil olmak üzere, artan okuma derinliğine (genomik kapsamın 40 katına kadar) olanak tanımış ve sonuç olarak okumalar arasındaki fikir birliği doğruluğunu %99,9’a kadar artırmıştır ( Nat Rev Genet 2020;21:597 )
  • Yüksek doğruluklu okumalar (PacBio platformları tarafından üretilenler gibi) daha fazla zaman ve kaynak (hesaplamalı işlem gücü dahil) gerektirir ve her şablon molekülü ve dizileme hücresi başına birden fazla okuma üretilmesi nedeniyle genomik birleştirme başına daha yüksek bir maliyetle sonuçlanır, ancak üretilen okumalar hem uzundur (> 10 Kb) hem de doğrudur (> %99) ( Nat Rev Genet 2020;21:597 )

Nanogözenek

• Diğer sistemlerle karşılaştırıldığında bu sistem nükleotidlerin dahil edilmesini izlemez veya ikincil bir sinyal (floresans, pH, vb.) kullanmaz.
• Dizileme mekanizması
  • İyonik akım nano gözenek proteinlerinden geçirilir
  • Hedef DNA daha sonra bir nano gözenekten geçirilir ve her baz akımı değiştirir
  • DNA molekülü nano gözeneklerden geçerken dizileme gerçek zamanlı olarak gerçekleşir
  • Saç tokası kütüphane yapısı ileri ve geri ipliklerin dizilenmesine olanak tanır (örneğin, Oxford Nanopore Technologies)
• Avantajları: çok uzun molekülleri sıralayabilir (standart uzunluk: 10 Kb ila 100 Kb; ultra uzun okumalar: > 100 Kb), daha düşük maliyet, küçük ve taşınabilir, gerçek zamanlı veri üretimi; de novo montaj, yapısal varyantlar ( Nat Rev Genet 2020;21:597 )
  • Platform başına akış hücrelerinin artmasıyla (örneğin, aynı anda 48 akış hücresi çalıştırabilen Oxford Nanopore Technologies’ PromethION), verim potansiyel olarak bazı kısa okuma tabanlı platformların (örneğin, Illumina NovaSeq) verimini aşabilir ( Nat Rev Genet 2020;21:597 )
• Dezavantajları: nispeten yüksek hata oranı ( Nat Rev Genet 2016;17:333 , J Biomed Biotechnol 2012;2012:251364 )
  • Temel çağrıların doğruluğu büyük ölçüde kullanılan algoritmalara bağlıdır; algoritmalardaki iyileştirmeler standart okumaların (10 – 100 Kb) ortalama doğruluğunu %87 – %98’e çıkarmıştır, fikir birliği okuma doğruluğu ise %97 – %98 civarındadır ( Nat Rev Genet 2020;21:597 )

Bilgisayar Bilimi

Genel bakış: Ham dizileme verileri ayrı dizilere (okumalar) çevrilir, her okuma genomdaki hedeflenen bölgesine eşlenir ve bu hizalama daha sonra örnek DNA ile standartlaştırılmış referans arasındaki farklılıkları belirler.

Baz çağrısı ve demultipleksleme: Ham formatlı veriler (floresan yoğunluğu, elektriksel uyarı, vb.) hedef DNA dizisindeki her bir pozisyona atanan bir nükleotid dizisine dönüştürülür (örneğin, ikili baz çağrısı (BCL) formatı)

• Sinyalin arka plan gürültüsüne göre yoğunluğu, temel çağrı algoritmasının her nükleotid ile ilişkili bir güven puanı oluşturmasına olanak tanır
• Okunan veriler, okuma tanımlayıcısı, nükleotid dizisi ve güven puanları içeren BCL’den FASTQ formatına dönüştürülerek demultiplekslenir
  • FASTQ formatı:
    • Satır 1: @Sequence tanımlayıcı (ve isteğe bağlı açıklama)
    • Satır 2: Ham dizi şu şekilde okunur: “ACTGACTG”
    • Satır 3: Boşluk: ‘+’
    • Satır 4: Satır 2’nin Phred kalite puanı (olasılık tabanı sıralayıcı tarafından yanlış bir şekilde çağrılmıştır): ‘!AA>**!C
    • S = -log(10)P
    • Q = Phred kalite puanı
    • P = Yanlış bir baz çağrısının olasılığı (tepe şekli ve bazlardaki örtüşme ile hesaplanır)
    • Örnek yazılım: CASAVA (Illumina)

Sıra hizalaması:

• Tüm bireysel okumaların genom üzerindeki konumlara eşlenmesi
• Okunan verilere ve bir referans dizisine (bireysel okumaların karşılaştırıldığı ve hizalandığı bir standart) ihtiyaç duyar
  • Biyolojik faktörler (iyi huylu varyantlar ve mutasyonlar) ve teknik faktörler (dizilemedeki hatalar veya yanlış baz çağrıları) kusurlu hizalamaya katkıda bulunur
  • Hatalı hizalama için cezalar üretilir; belirli bir ceza eşiğinde, bir okumanın hizalanamayacağı düşünülür
• Kapsam (derinlik): Bir nükleotidin dizilendiği zaman sayısı veya tek bir baz üzerinde hizalanan okumaların sayısı
  • Artırılmış kapsama, o konumdaki temel çağrıyı doğrular ve temel çağrının orijinal hedef dizisini doğru bir şekilde temsil ettiğine dair güveni artırır
  • Saf veya germ hattı örneğinde adı geçen bazdan emin olmak için yirmi kat kapsama (hedef bölge üzerinde 20 okuma, genellikle 20x olarak belirtilir) gereklidir
  • Tümör örnekleri gibi karışık örneklerdeki varyantları belirlemek için beş yüz ila bin kat (500 – 1.000x) kapsamaya ihtiyaç vardır
• Hizalama biçimleri: dizi hizalaması/haritası (SAM) ve ikili BAM biçimi, hizalama verilerini referans dizi konumuna göre dizinleyerek depolar
• Örnek yazılımlar: BWA, Bowtie 2, MAQ, Stampy, Novoalign

Varyant çağrı:

• Referans genoma hizalandıktan sonra, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP’ler), tek nükleotid varyantları (SNV’ler) ve ekleme/silmeler (indeller) tanımlanabilir
• Kapsam derinliğini, değişken frekansı ve hizalama puanını dikkate alır
• Dosya biçimi: varyant çağrı biçimi (VCF), mutasyon açıklama biçimi (MAF)
• Örnek yazılımlar: SAM araçları Mpileup, GATK

Verilerin görselleştirilmesi:

• Örnek yazılım: entegre genomik görüntüleyici (IGV), UCSC genom tarayıcısı , ENSEMBL genom tarayıcısı

Referans: Arch Pathol Lab Med 2017;141:1544 , Annu Rev Pathol 2020;15:97

NGS uygulamaları

DNA dizilimi

• Veri analizi: Nokta mutasyonlarını, eklemeleri/silmeleri (indeller), kopya sayısı varyantlarını (CNV’ler), yapısal varyantları; tümör mutasyon yükünü (TMB), mutasyon imzasını belirler
• Tüm genom dizilimi
  • Genomun hem kodlayan hem de kodlamayan bölgelerini sıralar
  • Avantajları: Kütüphane hazırlama zenginleştirme veya amplifikasyon gerektirmez (yüksek özgüllük)
  • Dezavantajları: yüksek maliyet, daha az derinlikte kapsam, karmaşık veri analizi ve yorumlama
• Tüm ekzom dizilimi
  • Genomun yalnızca protein kodlama alanının dizilenmesi (~%1 – 2)
  • Mutasyon tespiti için yeterli özgüllük ve duyarlılık için nükleotid başına > 20x kapsamaya ihtiyaç vardır
  • Avantajları: Klinik kullanım için daha uygun fiyatlıdır
• Hedeflenen dizileme
  • Genomun belirli bölgelerini dizilemek için spesifik primerlerle zenginleştirmeyi kullanır
  • Avantajları: Her dizileme reaksiyonunda daha fazla sayıda bireysel numunenin çalıştırılmasına olanak tanır, ilgi duyulan bölgelerin kapsanma derinliğini artırır ve maliyeti azaltır
• Gen panelleri
  • Genomik tıp
    • Kalıtsal sendromlar (örneğin Lynch sendromu, kalıtsal meme/yumurtalık kanseri sendromu) veya mitokondriyal hastalıklar
    • Germ hattı varyantlarını tespit etmek için 80x derinlik yeterlidir
  • Somatik mutasyonlar
    • Katı tümör ve hematolenfoid neoplazm panelleri
    • >Somatik mutasyonlar için 500x kapsamaya ihtiyaç var

RNA dizilemesi (RNA seq)

• Ters transkriptaz PCR’yi (RT PCR) kullanır
• Veri analizi: farklı ifade, gen füzyonları, alternatif ekleme ve RNA düzenleme

Diğer

• Metilasyon dizilemesi (metil seq): DNA metilasyon modellerini analiz etmek için bisülfitle işlenmiş DNA’yı kullanır
  • Ebeveyn baskısı gibi epigenetik değişiklikleri analiz etmek için yararlıdır
  • Metilasyon profili, MSS tümör sınıflandırması için de giderek daha önemli hale geliyor ( Neuro Oncol 2021;23:1231 )
• Kromatin immünoçöktürme (ChIP seq): Kromatin immünoçöktürme kullanılarak DNA protein etkileşimlerinin analizi ( Coleman: Diagnostic Molecular Pathology, 2016 , Genet Med 2013;15:733 )
• Dizileme ile transpozaza erişilebilir kromatin için deney (ATAC seq)
• Kes ve kaç

Klinik uygulamalar

Onkoloji testleri

Genellikle hematolojik veya solid malignitelere özgü somatik varyantları veya dizi varyantlarını tanımlamak için belirli gen panellerini kullanır.

• Tanıya yardımcı olur
• Prognostik bilgi sunar
• Etkili tedavi seçenekleri (hedefli tedaviler)
• BRAF V600E mutasyonu BRAF inhibitörü (örneğin vemurafenib) ile tedavi edilir

Ticari testler (örneğin FoundationOne) yüzlerce genomik bölgenin test edilmesine olanak tanır

• Dolaşımdaki tümör DNA’sını kullanarak kanser taraması ( Illumina: Illumina, Kan Bazlı Tarama Yoluyla Erken Kanser Tespiti Sağlamak İçin Yeni Bir Şirket Kuruyor [Erişim Tarihi 3 Mart 2023] )

Germ hattı testi

Germ hattı DNA varyantlarını tanımlamak için WES, WGS veya hedeflenen germ hattı panelleri kullanılır.

• Kalıtsal hastalıkları teşhis edin
• Muhtemelen genetik kökenli olan fenotipleri açıklayın
• Kanser yatkınlığını ( BRCA1 / BRCA2 veya TP53 mutasyonları vb.) belirlemek

Ticari testler SNP tespiti ve analizine olanak sağlar (örneğin, 23andme, Ancestry, Gene Dx, Ambry genetiği, vb.)

Mikrobiyoloji

WGS ve metagenomik dizileme yöntemleri şu amaçlar için kullanılır:

• Patojenlerin ve terapötik direnç mekanizmalarının tanımlanması
• Sağlık kuruluşlarının içinde ve dışında antimikrobiyal direncin izlenmesi
• Patojenlerin ve patojenik suşların genotiplendirilmesi yoluyla hastalık salgınlarının epidemiyolojik izlenmesi ( Clin Microbiol Infect 2018;24:335 , Genes (Basel) 2022;13:1566 )

Farmakogenomik

Genomik varyasyonları ilaç tepkisindeki veya ilaç-ilaç etkileşimlerindeki fenotipik farklılıklara bağlayın ( Cold Spring Harb Perspect Med 2019;9:a033027 )

Ortaya çıkan tanılamalar

Tek hücreli transkriptomik, uzaysal transkriptomik, tek hücreli ATAC dizisi

Optik genom haritalama (OGM)

• İlk olarak 1990 yılında tanıtılan genom görüntüleme tekniklerine dayanmaktadır
• Uzun, doğrusallaştırılmış DNA molekülleri (tek zincirli parça uzunlukları 0,15 – 2,5 Mb arasında değişen yüksek moleküler ağırlıklı DNA’dan türetilmiştir) dizi motifine özgü floresan işaretleyicilerle (genellikle 100 kb başına yaklaşık 15 etiket) etiketlenir, nano gözenek kanallarından geçirilir ve yüksek verimli görüntüleme yoluyla analiz edilir.
• Floresan etiketlerinin tespit edilen deseni daha sonra bir referans genom haritasıyla karşılaştırılan yeni bir genom oluşturmak için kullanılır
• Referans genom haritalarına göre etiket desenlerindeki varyasyonlar, eklemeler, silmeler, ters çevirmeler, yer değiştirmeler ve kromozomal aneuploidi dahil olmak üzere yapısal varyasyonları tespit etmek için kullanılır
• Faydalar
  • NGS ve karşılaştırmalı genomik hibridizasyon dizileri (aCGH) genetik varyantları dizi düzeyinde ve kopya sayısı varyasyonuna göre tespit edebilirken, OGM dengeli yapısal varyantları (örneğin ters çevirmeler ve dengeli translokasyonlar) ve karmaşık yapısal yeniden düzenlemeleri daha iyi tespit edebilir ve varyant kırılma noktalarının yüksek çözünürlüğüne sahip olabilir.
  • Tarihsel olarak dizilenmesi zor olan kromozomların tekrarlayan bölgeleri daha kolay haritalanabilir
    • Birçok genetik olay benzersiz olmayan/tekrarlayan dizilerde meydana geldiğinden, OGM, bu alanlardaki yapısal düzenlemeleri şu anda NGS ve aCGH ile yapılabilenden daha etkili bir şekilde tespit etme potansiyeline sahiptir
  • 500 bp kadar küçük eklemeler ve çıkarmalar tespit edilebilir
  • OGM verilerinin oluşturulması, geleneksel hücre kültürü ve karyotiplemeye kıyasla daha kısa bir geri dönüş süresine sahip olabilir ve bu da yapısal varyantların potansiyel olarak daha hızlı tanımlanmasına olanak tanır
• Sınırlamalar
  • Yapısal ve genetik varyantlar tespit edilebilecek veya çözülebilecek kadar büyük olmalıdır
  • Kromozomların bazı bölgeleri iyi haritalanmaz (örneğin, bazı çalışmalar X kromozomunun subtelomerik bölgesinin zayıf çözünürlüğünü ve sonrasında belirli yapısal yeniden düzenlemeleri tespit edememeyi bildirmektedir)
  • OGM analizleri, numune başına birden fazla yapısal varyantı belirleyebilir ve bazen onlarca ila yüzlerce (veya daha fazla) potansiyel varyantın belirlenmesiyle sonuçlanabilir.
    • Teknolojinin araştırma ve potansiyel olarak klinik ortamlardaki göreceli yeniliği göz önüne alındığında, mevcut veri filtreleme ayarları ve stratejileri sınırlıdır
    • Heterozigotluğun kopya sayısı nötr kaybı için analitik algoritmalar eksiktir
  • Mevcut referans haritaları nispeten küçük bir kohorttan türetilmiştir
  • Mevcut ölçeklendirme yetenekleri klinik uygulamalar açısından sınırlıdır.

Genel olarak, OGM, ölçek büyütme yeteneklerindeki gelişmeler ve analitik algoritmaların iyileştirilmesi beklenerek, tanı testlerine (ister birincil tanı testi ister diğer geleneksel çalışmalardan elde edilen sonuçların doğrulanması için olsun) yararlı bir katkı sağlamayı vaat ediyor ( Am J Hum Genet 2021;108:1423 , Genes (Basel) 2021;12:1958 ).